1、技術(shù)原理
植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)可分為兩大類：一類是直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，包括基因槍法、原生質(zhì)體法、脂質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法等，其中基因槍轉(zhuǎn)化法是代表。
另一類是生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法廣泛應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。
基因轉(zhuǎn)化-OE原理是將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中后，用含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌去侵染植物葉子切口，目的基因插入到經(jīng)過(guò)改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和整合，然后通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)，得到轉(zhuǎn)基因植物。當(dāng)構(gòu)建的表達(dá)載體含有高活性組成型啟動(dòng)子時(shí)，目的基因就會(huì)被高活性啟動(dòng)子啟動(dòng)在細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)，這就是基因轉(zhuǎn)化過(guò)量表達(dá)。
基因轉(zhuǎn)化-RNAi原理是在質(zhì)?；虿《据d體中，利用RNA聚合酶啟動(dòng)因子U6或T7分別控制正義鏈和反義鏈的合成并退火形成雙鏈siRNA，或在啟動(dòng)子下游設(shè)計(jì)帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)的表達(dá)單位，自身退火形成雙鏈siRNA。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中后，用含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌去侵染植物葉子切口，細(xì)胞中與目標(biāo)基因序列同源的雙鏈小RNA可以高效、特異性地阻斷目標(biāo)基因表達(dá)，促使mRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出目標(biāo)基因缺失的表型。在植物體中，RNAi被稱為基因共抑制，也是一種體內(nèi)抵御外在感染的重要保護(hù)機(jī)制。
2、技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1)模仿或利用天然的轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，成功率高，效果好；
2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的機(jī)理研究得最清楚，方法最成熟，應(yīng)用也最廣泛；
3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的外源基因以單拷貝為多數(shù)，遺傳穩(wěn)定性好，并且多數(shù)符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，因此轉(zhuǎn)基因植株能較好地為育種提供了中間選育材料；
4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)操作比較容易，需要的儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低，易于推廣。
3、應(yīng)用領(lǐng)域
1)生產(chǎn)重組疫苗、抑生長(zhǎng)素、胰島素、干擾素、人生長(zhǎng)激素等；
2)培育了一批具有抗蟲(chóng)、抗病、抗旱耐鹽、耐除草劑等性狀的轉(zhuǎn)基因作物；
3)改善作物農(nóng)藝性狀如光合效率、肥料利用效率和改善品質(zhì)等。
4、技術(shù)路線及時(shí)間周期
5、實(shí)施方案
1、目的基因克隆
1)引物設(shè)計(jì)：
基因轉(zhuǎn)化-OE：我們建議客戶提供目的基因的編碼序列（Coding sequence, CDS），根據(jù)CDS序列設(shè)計(jì)可擴(kuò)增完整CDS序列（無(wú)終止子）的特異性引物。因?yàn)椴皇撬凶x碼框（ORF）都能被表達(dá)出蛋白產(chǎn)物，或者能產(chǎn)生生物學(xué)功能的蛋白。
基因轉(zhuǎn)化-RNAi：我們建議客戶一般采用200-300 bp片段插入沉默載體中，實(shí)驗(yàn)采用pHellsgate8 載體。pHellsgate8 RNAi載體構(gòu)建方法采用BP重組反應(yīng)。根據(jù)目的基因序列與其他物種基因序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)RNAi載體引物A-RNAi-attB-F（含attB位點(diǎn)）和A-RNAi-attB-R（含attB位點(diǎn)）。
2)若客戶提供已測(cè)序驗(yàn)證的含有目的基因的T載體，則直接進(jìn)行第5)步；若客戶只提供植物材料，則進(jìn)行第3)步。
3)使用本公司專門(mén)針對(duì)物種特性開(kāi)發(fā)的RNA提取試劑盒進(jìn)行提取樣品總RNA提取。
4)反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA。
5)以cDNA或含有目的基因的T載體為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
6)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收。
7)使用DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA Topoisomerase)進(jìn)行TA連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定為陽(yáng)性的再測(cè)序驗(yàn)證。
8)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的TA質(zhì)粒置于-80℃保存。
2、構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體
本公司使用ClonExpress?技術(shù)，無(wú)須中間載體，一步將目的片段定向克隆進(jìn)入植物過(guò)表達(dá)載體中。詳細(xì)操作請(qǐng)見(jiàn)“載體構(gòu)建”?？筛鶕?jù)客戶需求使用不同抗性（卡那霉素、潮霉素、慶大霉素、除草劑）的植物表達(dá)載體。
3、凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
用凍融法將過(guò)表達(dá)載體和RNAi載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株（GV3101、LBA4404、EHA105可選）中，具體操作如下：
1)吸取5-10 μl質(zhì)粒DNA加入100 μl融化后感受態(tài)細(xì)胞，上下吹吸均勻，冰上放置30 min。
2)將混合液放入液氮中1 min。
3)將混合液取出，轉(zhuǎn)入37℃水浴5 min融化后，加入650 μl新鮮LB液體培養(yǎng)基，28℃，150 rpm/min低速振蕩3 h左右。
4)8,000 rpm離心30 sec，去上清，加100 μl液體培養(yǎng)基，懸浮菌體后涂于含抗生素和利福平的LB固體培養(yǎng)基中。
5)獲得的轉(zhuǎn)化菌株用于農(nóng)桿菌侵染。
4、組培無(wú)菌苗，制備外植體
1)用75%的乙醇和20%次氯酸鈉溶液分別依次漂洗種子10 min，再用無(wú)菌水漂洗3次，每次3 min，然后放在1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)煙苗長(zhǎng)到四片葉左右時(shí)，取嫩葉進(jìn)行分化。
2)將新鮮的無(wú)菌煙草葉片剪成1 cm見(jiàn)方的小塊，接種于不含任何抗生素的煙草分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 d。煙草分化培養(yǎng)基為MS+2.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA, 蔗糖 30 g/L, 瓊脂6 g/L， ph=5.8;
5、農(nóng)桿菌侵染，誘導(dǎo)出芽
1)在取煙草外植體的同時(shí)將含有過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種于含適當(dāng)濃度的抗生素和利福平的YEB培養(yǎng)基中，28℃，250 rpm/min，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；
2)將飽和的農(nóng)桿菌菌液按1:100的比例注入到不含任何抗生素的YEB培養(yǎng)基中，28°C，250 rpm/min，振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5左右；
3)將預(yù)培養(yǎng)兩天的煙草外植體浸到活化好的農(nóng)桿菌菌液中10 min；
4)用濾紙將外植體上的殘余菌液吸干，之后接種于不含任何抗生素的分化培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)兩天；
5)將暗培養(yǎng)過(guò)的外植體轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上，每10 d繼代一次。
6)再生苗長(zhǎng)到1-2CM時(shí)切下，轉(zhuǎn)入伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中瓶中培養(yǎng)。
6、抗性T0代植株再生
將分化出的不定芽移入生根培養(yǎng)基中生根，生根培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L NAA+ PPT 4 mg/L + Timentin 160 mg。
7、PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株
待試管苗長(zhǎng)到3-4片時(shí)，揭開(kāi)封口膜，取少量葉子提取DNA，根據(jù)載體特有序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。
8、煉苗移栽（可選）
PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的植株，在光照培養(yǎng)室中煉苗3-4 d，然后移栽到培養(yǎng)缽中。
9、收獲T1代種子（可選）
加快生長(zhǎng)周期，單株套袋，收獲種子。
6、服務(wù)內(nèi)容 周期 驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)
目的基因克隆 3個(gè)工作日 PCR電泳圖、測(cè)序報(bào)告
植物表達(dá)載體構(gòu)建 10個(gè)工作日 PCR/酶切電泳圖、測(cè)序報(bào)告
煙草遺傳轉(zhuǎn)化 約2個(gè)月 植株DNA PCR擴(kuò)增目的基因電泳圖特異條帶
煉苗移栽（可選） 15個(gè)工作日 -
收獲T1代種子（可選） 加速生長(zhǎng)周期 -
目的基因轉(zhuǎn)錄qRT-PCR檢測(cè)(可選） 10個(gè)工作日 目的基因轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)
目的基因Southern blot（可選） 20個(gè)工作日 雜交電泳圖
目的基因蛋白Western blot（可選） 20個(gè)工作日 雜交電泳圖
