一、實驗原理與方法概述
HRP標記抗體常用的兩種方法為：
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過碘酸鈉法（簡易法）：利用過碘酸鈉將HRP分子中的糖基氧化為醛基，再與抗體氨基結合，形成Schiff堿結構。
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戊二醛兩步法：先將HRP與戊二醛反應，形成HRP-戊二醛復合物，再與抗體反應，形成HRP-抗體復合物。
本規范主要介紹過碘酸鈉法的操作步驟。
二、實驗材料與試劑
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HRP（辣根過氧化物酶）：≥4 mg，純度高（RZ值≥3）。
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抗體：IgG類抗體，濃度≥2 mg/mL。
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過碘酸鈉（NaIO?）：0.06 mol/L，現配現用。
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乙二醇：0.16 mol/L，終止氧化反應。
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氫化硼鈉（NaBH?）：4 mg/mL，穩定Schiff堿結構。
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PBS緩沖液：0.15 mol/L，pH 7.4，用于透析。
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甘油：60%，用于保存。
Sephadex G-25層析柱：用于去除未反應試劑。
三、操作步驟
1. HRP的醛化處理
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稱取5 mg HRP，溶解于1 mL去離子水中。
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加入0.2 mL新配制的0.06 mol/L NaIO?溶液，室溫避光攪拌30分鐘，溶液呈黃綠色。
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加入1 mL0.16 mol/L乙二醇溶液，繼續室溫攪拌1小時，終止氧化反應。
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將反應液裝入透析袋中，對1×PBS（pH 7.4）透析過夜，換液3次。
2. HRP-抗體偶聯反應
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將透析后的醛化HRP溶液與5 mg抗體溶解于1 mL0.01 mol/L碳酸鹽緩沖液中，室溫避光攪拌2小時。
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加入0.1 mL新配制的4 mg/mL NaBH?溶液，混勻，4℃放置2小時，穩定Schiff堿結構。
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將反應液裝入透析袋中，對0.15 mol/L PBS（pH 7.4）透析過夜，換液3次。
3. HRP-抗體純化與保存
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透析后，使用Sephadex G-25層析柱去除未反應試劑。
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收集純化后的HRP-抗體溶液，加入等體積60%甘油，分裝于小瓶中。
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分裝后的溶液可在-20℃保存，以防止反復凍融。
四、質量控制與鑒定
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酶活性測定：使用DAB-H?O?顯色反應法檢測HRP活性。
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抗體活性測定：通過ELISA法或免疫擴散法檢測抗體活性。
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克分子比值（E/P）測定：使用分光光度計測定OD280和OD403，計算E/P比值。
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標記效率：E/P比值一般為1-2，標記效率應在0.3-0.6之間。
五、注意事項
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所有操作應在避光條件下進行，防止HRP活性喪失。
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使用新鮮配制的試劑，避免試劑降解影響實驗結果。
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透析過程中應注意更換緩沖液，確保去除未反應試劑。
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保存HRP-抗體溶液時，應避免反復凍融，以保持其活性。
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