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實驗簡介

本實驗用于檢測以辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）標記的細胞，采用顯色底物體系對目標抗體或蛋白進行定位顯示。

實驗材料

試劑

• HRP標記抗體孵育好的細胞

• 3% H2O2（過氧化氫）

• Diaminobenzidine (DAB) 四鹽酸鹽

• 0.05 M Tris緩沖液 (pH 7.6)

• 0.3% (w/v) Nickel chloride 或 Cobalt chloride 溶液

• Chloronaphthol 和 絕對乙醇

• Aminoethylcarbazole (AEC) 和 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）

• 0.1 M Sodium acetate buffer (pH 5.2)

耗材與器材

• Whatman No. 1 濾紙

• 載玻片、蓋玻片

• DPX封片劑或Gelvatol、Mowiol

操作方法

1?? DAB 顯色法

1. 將 6 mg DAB 溶解于 10 mL 0.05 M Tris緩沖液 (pH 7.6)

2. 加入 0.1 mL 3% H2O2

3. 若有沉淀，過濾

4. 將工作液加至細胞標本上，室溫孵育 1–20 分鐘

5. 用蒸餾水終止反應

6. 可選：復染，封片

2?? DAB + 金屬鹽增強顯色法

1. 將 6 mg DAB 溶于 9 mL Tris緩沖液

2. 加入 1 mL 0.3% Nickel chloride 或 Cobalt chloride

3. 再加入 0.1 mL 3% H2O2

4. 若有沉淀，過濾

5. 加至細胞標本，室溫孵育 1–20 分鐘

6. 用蒸餾水終止反應

7. 可選：復染，封片

3?? Chloronaphthol 顯色法

1. 將 0.3 g Chloronaphthol 溶于 10 mL 絕對乙醇，低溫保存

2. 取 100 μL 儲備液于 10 mL Tris緩沖液 中

3. 加入 0.1 mL 3% H2O2

4. 過濾去除沉淀

5. 將顯色液加入細胞，室溫孵育 10–40 分鐘

6. 用蒸餾水終止反應

7. 可選：復染，封片

4?? AEC 顯色法

1. 將 1.0 mL 0.4% AEC 溶液加入 15 mL 0.1 M Sodium acetate buffer (pH 5.2)

2. 加入 0.15 mL 3% H2O2

3. 過濾

4. 顯色液加至細胞，室溫孵育 10–40 分鐘

5. 用蒸餾水終止反應

6. 可選：復染，封片

注意事項

• DAB及AEC需避光操作，AEC產物易褪色，操作需避免氣泡

• 所有含H2O2溶液現配現用，使用30%母液稀釋

• 復染建議參照 Rodig 2019《Counterstaining, Mounting, and Photographing Stained Cells》

• 注意配制液體pH值及溶液保質期

參考文獻

Rodig SJ. 2019. Counterstaining, Mounting, and Photographing Stained Cells. Cold Spring Harb Protoc doi:10.1101/pdb.prot099770 IF: NA NA NA