患者源性腫瘤類器官（PDTO）作為可靠的臨床前模型，能夠真實(shí)反映原發(fā)腫瘤的生理學(xué)特征，在腫瘤學(xué)基礎(chǔ)研究、疾病建模、新藥物研發(fā)和個(gè)性化治療中具有重要意義。近期，有研究團(tuán)隊(duì)通過將腫瘤組織碎片中制備獲得的中尺度膠原束與明膠相結(jié)合，制備了一種新型的仿生水凝膠（新型-gel），用于培養(yǎng)來自患者的腫瘤類器官。研究指出，新型-gel中培養(yǎng)的肺癌類器官（LCOs）相較于無中尺度膠原束的Con-gel，在直徑、細(xì)胞活性和形態(tài)上顯示顯著提升，更貼近體內(nèi)腫瘤的特征。此外，這些LCOs在新型-gel中保持了與原始腫瘤組織類似的組織學(xué)特征、突變譜、基因表達(dá)和藥物反應(yīng)，展示出廣泛的應(yīng)用潛力，有助于推動(dòng)個(gè)性化醫(yī)療和定制治療策略的發(fā)展。
創(chuàng)新點(diǎn)
復(fù)合水凝膠（新型-gel）的制備和表征。
新型-gel 支持患者來源的腫瘤類器官的活力和生長(zhǎng)。
新型-gel 有效地再現(xiàn)了肺癌類器官中親本腫瘤觀察到的組織學(xué)和突變特征。
使用 新型-gel 培養(yǎng)的肺癌類器官仍保持了藥物敏感性和長(zhǎng)期培養(yǎng)能力
為了在體外模擬中等尺度膠原結(jié)構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)，作者利用腫瘤源性的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)碎片制備獲得中等尺度膠原束（新型B）。這些膠原束平均長(zhǎng)度為90 ± 27 μm，平均直徑為5 ± 1.5 μm。ECM碎片經(jīng)過-80°C三次凍融去細(xì)胞化處理，有效去除了組織中殘留的腫瘤細(xì)胞。在解凍后，利用高通量組織細(xì)胞粉碎機(jī)快速機(jī)械破碎誘導(dǎo)形成中等尺度的膠原束(圖1)。
圖1 中等微觀尺度的復(fù)合水凝膠制備
為了探索具有中等尺度膠原結(jié)構(gòu)的仿生水凝膠在增強(qiáng)來源于原發(fā)性肺癌細(xì)胞的肺癌類器官（LCOs）生長(zhǎng)和遷移方面的能力，作者培養(yǎng)了18個(gè)LCOs，這些細(xì)胞直接來自原發(fā)性肺癌組織。在新型-gel中培養(yǎng)的LCOs呈現(xiàn)不規(guī)則的形態(tài)，與體內(nèi)觀察到的腫瘤特征一致，而對(duì)照組則顯示為球狀類器官。同時(shí)，選擇將傳統(tǒng)Matrigel和添加明膠的納米級(jí)膠原（Nano-gel）作為對(duì)照組。結(jié)果表明，在新型-gel中的LCOs與Matrigel和Nano-gel中的相比，細(xì)胞數(shù)量更多，直徑更大。此外，作者從肉瘤和甲狀腺癌樣本中獲得了中等尺度膠原束，這兩種類型的腫瘤類器官在新型-gel中得到了有效復(fù)現(xiàn)(圖2)。
圖2 新型-gel促進(jìn)了患者源性LCOs的生長(zhǎng)和繁殖
在新型-gel中培養(yǎng)的LCOs能夠準(zhǔn)確復(fù)制其母體癌組織的組織學(xué)特征至關(guān)重要。研究采用H&E染色和免疫熒光染色技術(shù)比較了在新型-gel中培養(yǎng)的LCOs與其母體肺癌組織的形態(tài)和分子特征。從肺腺癌細(xì)胞中衍生的LCO-4顯示腺泡或大腺體結(jié)構(gòu)，類似于其母體癌組織的結(jié)構(gòu)，而在新型-gel中培養(yǎng)的LCO-4顯示了與肺腺癌相關(guān)的分子標(biāo)記物表達(dá)，包括napsin-A、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1、細(xì)胞角蛋白7以及細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67，結(jié)果表明這種分子模式與其母體肺癌組織高度一致。綜合表明，在新型-gel中培養(yǎng)的腫瘤類器官能夠精確復(fù)制其母體腫瘤的組織學(xué)特征(圖3)。
圖3 新型-gel水凝膠培養(yǎng)的LCOs再現(xiàn)了親代腫瘤的組織病理特征
新型-gel水凝膠中培養(yǎng)的LCOs保留了原始腫瘤的遺傳學(xué)譜。通過WES分析4對(duì)原發(fā)性肺癌組織及其在Con-gel和新型-gel中的匹配LCOs，驗(yàn)證它們保留了母體腫瘤的遺傳突變。LC組織與其相應(yīng)LCOs表現(xiàn)出83.3%至97%的高一致性。新型-gel中的LCOs的變異等位基因頻率（VAF）分布與原始LC組織非常相似。在Con-gel和新型-gel中培養(yǎng)的LCOs保留了TP53、BCLAF1等驅(qū)動(dòng)突變，以及USP8、KEAP1等癌變基因的遺傳變化。LC組織與相應(yīng)LCOs之間的基本體細(xì)胞突變模式得以良好保留，主要堿基替換類型包括C > T/G（Ti）和C > A/G > T轉(zhuǎn)換（Tv），與肺癌突變譜一致。進(jìn)一步RNA測(cè)序分析顯示，新型-gel和Con-gel中培養(yǎng)的LCOs的基因表達(dá)譜高度一致，整體基因表達(dá)相關(guān)性超過0.948。PCA結(jié)果顯示新型-gel中培養(yǎng)的LCOs能有效地保留其在Con-gel中觀察到的RNA表達(dá)特性(圖4)。
圖4 新型-gel水凝膠培養(yǎng)的LCOs保留了原始組織的遺傳特征
新型-gel培養(yǎng)的LCOs保持藥物敏感性。作者評(píng)估了在新型-gel中培養(yǎng)的六種LCOs對(duì)肺癌常用藥物（阿霉素、順鉑、厄洛替尼和紫杉醇）的藥物敏感性。培養(yǎng)7至10天后，LCOs經(jīng)過3至5天的藥物處理，然后評(píng)估其細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，不論是在Con-gel還是新型-gel中培養(yǎng)的LCOs都展示出一致的藥物反應(yīng)模式，表明中尺度膠原束并未顯著改變化療藥物的敏感性。然而，不同患者來源的LCOs在Con-gel和新型-gel中對(duì)四種化療藥物的反應(yīng)差異顯著。例如，LCO-1對(duì)所有藥物均無敏感性，而LCO-2對(duì)阿霉素和厄洛替尼敏感，但對(duì)順鉑和紫杉醇表現(xiàn)出耐藥性(圖5)。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了進(jìn)行快速的體外藥物敏感性測(cè)試以優(yōu)化個(gè)體化化療方案的重要性。
圖5 conc -gel和新型-gel中培養(yǎng)類器官的藥物測(cè)試
與傳統(tǒng)的 M-gel比較：
新型-gel 通過使用直接來自患者的膠原束成分，提供了一種更加個(gè)性化的方法，與來自 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤細(xì)胞的 Matrigel 相比 ，這表明 新型-gel 更適合個(gè)性化患者治療。此外，MC-gel 的楊氏模量為 12.56 ± 2.7 kPa ，與肺腫瘤組織的楊氏模量 (12.73 kPa) 非常接近，而 Matrigel 的楊氏模量通常約為 1.29 kPa 。此外，新型-gel 旨在復(fù)制腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)雜的膠原結(jié)構(gòu)，這對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞表型、機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)因子通訊、長(zhǎng)距離細(xì)胞間相互作用和癌細(xì)胞浸潤(rùn)有顯著影響。
文章信息：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.04.035
方法：
1.中尺度膠原束制備
用冷 PBS 將腫瘤樣本清洗兩次，然后切成 1-2.5 mm3用剪刀將組織切成碎片。隨后將切碎的組織與 5 ml 膠原酶Ⅰ（3 mg/ml）和 ROCK 抑制劑 Y-27632 二鹽酸鹽（10 μM）一起在 15 ml 離心管中孵育 1.5 h，使用恒溫培養(yǎng)振蕩器（WS20，上海）設(shè)定轉(zhuǎn)速為 50 rpm，維持在 37 °C，直到觀察到大量絮狀沉淀和細(xì)胞懸浮液。消化后，將組織樣本通過細(xì)胞過濾器（70 μM）以從單細(xì)胞懸浮液中分離出大的未消化的簇。隨后將大的未消化的簇在 ?80 °C 和室溫下進(jìn)行多次凍融循環(huán)以消除剩余的細(xì)胞。隨后，使用組織研磨機(jī)（Fish Scientific）以 6.5 m/s 的速度在 4 °C 下將剩余的纖維均質(zhì)化。均質(zhì)化過程包括搖動(dòng) 1 分鐘，然后保持 1 分鐘，總共重復(fù) 7 個(gè)循環(huán)。這導(dǎo)致生成中等大小的膠原束，長(zhǎng)度約為 90 ± 27 μm，平均直徑為 3.5 至 6.5 μm。隨后將中等大小的膠原纖維浸泡在 75% 酒精中 1 小時(shí)，使其滅菌并失活，然后用無菌去離子水徹底清洗（4-5 次）以保存。將中等大小的膠原纖維浸泡在75%酒精中1小時(shí)進(jìn)行滅菌和滅活，然后用無菌去離子水徹底清洗（4-5次）以供保存。將中等大小的膠原纖維浸泡在75%酒精中1小時(shí)進(jìn)行滅菌和滅活，然后用無菌去離子水徹底清洗（4-5次）以供保存。
2.彈性模量測(cè)量
根據(jù)制造商的說明，使用位移控制的 PIUMA 納米壓痕儀（Optics11，荷蘭阿姆斯特丹）進(jìn)行納米壓痕測(cè)試。簡(jiǎn)而言之，使用 Pattex 膠將具有不同濃度中尺度膠原蛋白束的 mTGase 交聯(lián)明膠固定在玻璃底盤上。球形尖端半徑為 50 μm ( k = 0.5 N/m) 用于樣品測(cè)試。在每組實(shí)驗(yàn)之前，通過在固體表面施加壓力并建立懸臂彎曲和探針位移之間的等效性來校準(zhǔn)懸臂彎曲。校準(zhǔn)后，將裝有樣品的盤子放在 PIUMA 樣品臺(tái)上。樣品在室溫下浸入 PBS 中，確保納米壓痕儀尖端在整個(gè)過程中保持在溶液表面以下，以防止由空氣-水界面的強(qiáng)粘附力引起的誤差。每個(gè)樣品的應(yīng)力測(cè)試進(jìn)行 5-6 次，確保測(cè)量之間的最小距離為 200 μm。每個(gè)樣品的有效楊氏模量是通過多次測(cè)量計(jì)算出來的。每組至少進(jìn)行四次獨(dú)立測(cè)試以進(jìn)行量化。
3. 流變測(cè)量
采用美國(guó)TA Instruments公司的HR20旋轉(zhuǎn)流變儀對(duì)材料進(jìn)行流變性能評(píng)價(jià)，該設(shè)備具有精密設(shè)計(jì)的直徑20 mm測(cè)試平臺(tái)，間隙尺寸為500 μm。在允許180 s的熱平衡時(shí)間后，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，系統(tǒng)溫度恒定為25 ℃。應(yīng)變掃描實(shí)驗(yàn)中施加的應(yīng)變從0.1 %變化到100 %。在頻率掃描實(shí)驗(yàn)中，在頻率從0.1 %變化到100 %時(shí)，保持1 %的恒定應(yīng)變值。最后，在應(yīng)力松弛實(shí)驗(yàn)中，采用2 %的固定應(yīng)變?cè)O(shè)置，總測(cè)試時(shí)間為600 s。
4.. 掃描電子顯微鏡（SEM）
制備新型凝膠和 Con 凝膠，并在液氮中速凍 10 分鐘。隨后，在 2 Pa 的壓力下對(duì)它們進(jìn)行 24 小時(shí)的冷凍干燥，以保持其多孔結(jié)構(gòu)的完整性。使用手術(shù)刀小心地切割冷凍干燥的樣品，并將其固定在鋁制支架上。隨后，通過濺射涂層將一層金涂在樣品上，然后用 SEM（HITACHI，Regulus 8100）對(duì)其多孔形態(tài)進(jìn)行成像，加速電壓為 20 kV，初始放大倍數(shù)為 100 倍。對(duì)于孔徑測(cè)量，每組量化了超過 100 個(gè)孔。
5. 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）
使用VERTEX70紅外光譜儀（德國(guó)布魯克）在反射ATR模式下對(duì)凍干水凝膠樣品進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析，光譜范圍為400~4000cm ?1，從而獲取有關(guān)化學(xué)官能團(tuán)組成的微觀信息。
6.膨脹系數(shù)
準(zhǔn)確稱量新型凝膠和 Con 凝膠，然后在室溫下浸泡在過量蒸餾水中，孵育時(shí)間為 0、2、6、12 和 24 小時(shí)。然后，用鑷子小心地取出膨脹的水凝膠，用濾紙輕輕擦拭以消除任何表面水分，然后重新稱重。重復(fù)該過程，直到達(dá)到一致的重量。膨脹率是通過使用提供的公式計(jì)算三個(gè)值的平均值來確定的。膨脹率 = (Wb - Wa)/Wa × 100 %。其中，Wb 表示濕支架的重量，而 Wa 表示干支架的重量。
7.類器官培養(yǎng)
將按照“中尺度膠原束制備”部分所述方法獲得的細(xì)胞懸浮液以 1000 g 離心 5 分鐘，然后用 PBS 清洗，再以 1000 g離心 5 分鐘。最后，將腫瘤細(xì)胞重新懸浮在濃度為 4% 的明膠溶液中。將 10 滴由 新型 凝膠（約 20 μL）和細(xì)胞（約 20,000 個(gè)細(xì)胞/滴）組成的混合物滴入六孔板的每個(gè)孔中。將它們小心地放入 37 °C 的環(huán)境中，在 5% 的 CO2 濃度下進(jìn)行進(jìn)一步孵育。凝固后，每個(gè)孔添加肺癌類器官培養(yǎng)基（2 毫升）。
8.H&E 染色和 IF 分析
將新鮮的肺腫瘤組織首先浸泡在10％福爾馬林溶液中24至48小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到70％乙醇溶液中進(jìn)一步保存，再包埋在石蠟中。在新型-gel和Con-gel中培養(yǎng)的類器官浸泡在4％福爾馬林溶液中24-48小時(shí)，然后用70％乙醇溶液中的伊紅處理，再包埋在瓊脂糖（2％）中，進(jìn)行后續(xù)處理，包括H&E染色和免疫熒光（IF）分析。將包埋在石蠟中的腫瘤組織和類器官切成厚度約為4μm的切片，并在60°C的溫度下干燥過夜。對(duì)于免疫熒光實(shí)驗(yàn)，使用檸檬酸溶液（pH 6）對(duì)石蠟載玻片進(jìn)行抗原修復(fù)。) 脫蠟和復(fù)水后。使用一抗 Napsin A (ABclonal, A5594)、細(xì)胞角蛋白 5/6 (CK5/6) (Proteintech, 28506-1-AP)、TP63 (Proteintech, 12143-1-AP)、TTF-1 (ABclonal, A18128)、細(xì)胞角蛋白 7 (CK7, Proteintech, 17513-1-AP)、Ki67 (Proteintech, 27309-1-AP) 對(duì)制備的組織切片進(jìn)行適當(dāng)?shù)目贵w染色。然后用 PBS 沖洗載玻片，并在 25 °C 下與稀釋的二抗一起孵育 1 小時(shí)。用 DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核。隨后，使用 Leica 制造的共聚焦顯微鏡 (LSM900) 掃描和捕獲載玻片。TTF-1 (ABclonal，A18128)、細(xì)胞角蛋白 7 (CK7，Proteintech，17513-1-AP)、Ki67 (Proteintech，27309-1-AP)。然后用 PBS 沖洗載玻片，并在 25°C 下與稀釋的二抗孵育 1 小時(shí)。用 DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核。隨后，使用 Leica 制造的共聚焦顯微鏡 (LSM900) 掃描和捕獲載玻片。TTF-1 (ABclonal，A18128)、細(xì)胞角蛋白 7 (CK7，Proteintech，17513-1-AP)、Ki67 (Proteintech，27309-1-AP)。然后用 PBS 沖洗載玻片，并在 25°C 下與稀釋的二抗孵育 1 小時(shí)。用 DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核。隨后，使用 Leica 制造的共聚焦顯微鏡 (LSM900) 掃描和捕獲載玻片。
9. DNA提取及全外顯子組測(cè)序（WES）分析
使用 QIAamp DNA FFPE 組織試劑盒 (QIAGEN, 56404) 提取總 DNA，然后使用 Covaris M220 聚焦超聲波破碎儀進(jìn)行碎裂，隨后進(jìn)行測(cè)序文庫構(gòu)建準(zhǔn)備。根據(jù)供應(yīng)商提供的制造商協(xié)議，使用 Human Exome 2.0 Plus 試劑盒 (Twist Bioscience) 進(jìn)行外顯子組捕獲。在 LC-Bio Technology Co., Ltd (中國(guó)杭州) 使用 Illumina NovaSeq 6000 測(cè)序系統(tǒng) (Illumina) 對(duì)最終文庫進(jìn)行雙端 150 bp 測(cè)序。比對(duì)之前，使用 fastp 軟件消除包含測(cè)序接頭或具有 q 質(zhì)量20 的核苷酸的低質(zhì)量讀取。為了比對(duì)目的，我們使用了 BWA (Burrows Wheeler Aligner) 將讀取與 hg19 參考基因組對(duì)齊。比對(duì)后處理包括使用 Broad Institute 存儲(chǔ)庫網(wǎng)站上的 Picard 工具識(shí)別和標(biāo)記重復(fù)讀取。此外，還進(jìn)行了第二次比對(duì)后處理步驟，通過實(shí)施局部讀取重新比對(duì)來解決插入/缺失附近的潛在比對(duì)錯(cuò)誤。為了在變異調(diào)用之前減輕系統(tǒng)性偏差，對(duì)堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行了重新校準(zhǔn)。通過結(jié)合使用 Mutect2 算法檢測(cè)體細(xì)胞 SNV 和 InDel，而 ANNOVAR 將生物學(xué)信息納入變異集。使用 CNVkit 軟件工具集檢測(cè)拷貝數(shù)變異 。根據(jù)序列的GC含量對(duì)讀取分布進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，有助于計(jì)算腫瘤和正常樣本之間的拷貝數(shù)差異。
10. RNA測(cè)序
按照制造商的指導(dǎo)，使用 Trizol 試劑 (thermofisher, 15596018) 提取總 RNA。隨后，我們使用 Bioanalyzer 2100 Nano LabChip Kit (Agilent, 5067-1511) 評(píng)估分離 RNA 的數(shù)量和純度。為了構(gòu)建測(cè)序文庫，僅使用 RIN 數(shù)超過 70 的高質(zhì)量 RNA 樣本。為了從 5ug 總 RNA 中分離 mRNA，使用 Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, 61005) 進(jìn)行了兩個(gè)純化循環(huán)。隨后使用二價(jià)陽離子 (NEB, e6150) 在 94 °C 下對(duì)純化的 mRNA 進(jìn)行 5-7 分鐘的片段化。使用 SuperScript? II 逆轉(zhuǎn)錄酶 (Invitrogen, 1896649) 通過 cDNA 合成將片段化的 RNA 轉(zhuǎn)化為互補(bǔ) DNA。接下來，DNA聚合酶I（NEB，m0209），RNase H（NEB，m0297），我們利用 R 進(jìn)行相關(guān)性分析，通過新型-gel 和 Con-gel 中類器官平行實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性來評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和操作穩(wěn)定性。為了評(píng)估樣品之間的一致性，我們計(jì)算了 新型-gel 和 Con-gel 中四對(duì)類器官之間的 Pearson 相關(guān)系數(shù)。相關(guān)系數(shù)越高，表示在這些平行實(shí)驗(yàn)中觀察到的可重復(fù)性程度越高。對(duì)于本研究，我們使用 R 中的 princomp 函數(shù)進(jìn)行主成分分析 (PCA)。
11.體外藥物研究
用于在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中進(jìn)行藥物測(cè)試的化合物，從 MedChemExpress 獲得，并根據(jù)提供的指南溶解在二甲基亞砜 (DMSO) 或 PBS 中。將類器官解離成單個(gè)細(xì)胞、定量，然后接種在黑色 96 孔板中，每個(gè)孔有三個(gè)重復(fù)，每個(gè)孔包含 10,000 個(gè)細(xì)胞。這些培養(yǎng)皿孵育 7-10 天的生長(zhǎng)期。隨后將類器官暴露于 10 μmol/L 藥物濃度中 3-5 天。之后，按照制造商提供的說明，使用 CellTiter-Lumi? 發(fā)光檢測(cè)試劑盒評(píng)估三維 (3D) 細(xì)胞 (Beyotime, C0061S) 的活力，從而評(píng)估細(xì)胞活力。為了在數(shù)據(jù)分析過程中標(biāo)準(zhǔn)化不同板之間的差異，我們計(jì)算了對(duì)照百分比。僅用 DMSO 處理的孔中獲得的信號(hào)作為我們的陰性對(duì)照，設(shè)置為 0%，而每個(gè)單獨(dú)的板上未經(jīng)任何藥物處理的孔則被指定為 100%。相對(duì)細(xì)胞存活率是根據(jù)三個(gè)生物學(xué)重復(fù)來確定的。
1. 3D 細(xì)胞/類器官培養(yǎng)水凝膠的替代
Kemigel?——自組裝短肽水凝膠
Kemigel?是北京密碼子生物公司提供的合成肽水凝膠,具有可調(diào)節(jié)的剛度和功能，可模擬不同組織的細(xì)胞外基質(zhì)，并且沒有批次間的差異，讓您每次都有信心獲得可靠和一致的結(jié)果。 Kemigel?的水凝膠具有固有的生物相容性和可生物降解性，為您提供將研究轉(zhuǎn)化為臨床并提供改變生活的療法的潛力。
自組裝短肽技術(shù)最初源自于Zhang院士(世界著名科學(xué)家、奧地利科學(xué)院、美國(guó)麻省理工學(xué)院)，自組裝短肽技術(shù)已經(jīng)發(fā)表過＞10000+論文，其中關(guān)于細(xì)胞三維培養(yǎng)＞500篇，類器官培養(yǎng)的＞100篇。我們團(tuán)隊(duì)在國(guó)際國(guó)內(nèi)較高水平學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表論文如包括Biomaterials，CR，NPJ等以一作或者通訊作者發(fā)表的代表性的5篇SCI英文文章2021年統(tǒng)計(jì)總影響因子暫為>152.5，其中單篇現(xiàn)在的最高影響因子為～72.0。
Kemigel? 自組裝短肽的特點(diǎn)
1）化學(xué)合成純度可控，批次穩(wěn)定；
2）生物相容性較好；
3）自組裝動(dòng)態(tài)過程,利用非共價(jià)鍵；
4）支架具有納米級(jí)的結(jié)構(gòu)層次；
5）結(jié)構(gòu)較單一，雜質(zhì)控制在有限的價(jià)格區(qū)間，其成分易控制；
6）不來源于動(dòng)物，免疫原性小；
7）不會(huì)帶傳染病毒或疾病等，或者可能性極小；
8）降解成為氨基酸殘基；
9）提供仿生的生長(zhǎng)環(huán)境，基本可模擬體內(nèi)的真實(shí)環(huán)境；
10）可以單獨(dú)使用，也可組合使用
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