Yeast HiPure Plasmid Maxi Kit

酵母高純度質粒大量快速提取試劑盒

目錄號：PE114

適用范圍：

適用于大規模高純度酵母質粒制備。

試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。

儲存事項:

1、第一次使用時，將試劑盒所帶的全部RNase A加入溶液YA（終濃度100μg/ml）置于4℃保存。如果溶液YA中RNase A失活，提取的質粒可能會有微量RNA殘留，在溶液YA中補加RNase A即可。

2、環境溫度低時溶液YB中SDS可能會析出渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

3、避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

產品介紹：

本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞并結合破壁酶LE特異消化酵母細胞壁，能在1小時內從酵母培養液中分離出高純度質粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶LE去除細胞壁后,然后堿裂法裂解細胞，離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低PH值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除， 最后低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅基質膜上洗脫。

產品特點：

1、離心吸附柱內硅基質膜全部采用世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。

2、快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。獲得的質粒產量高、純度好，可以直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。

注意事項

1、所有的離心步驟如未加另外說明均在室溫完成，使用轉速可以達到至少6,000xg，帶50ml轉頭的臺式離心機。

2、溶液YC和去蛋白液PD中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

3、通常酵母質粒拷貝數都很低，高拷貝質粒最大得率一般為每5 ml 培養物提取1μg左右的質粒。用于下游試驗時通常建議使用量為： 1-5μl用做PCR 模板;5-10μl 用于轉化大腸桿菌,選擇高效率的感受態細胞。

4、得到的質粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260值為1相當于大約50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成， 與提取物培養時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。本公司產品正常操作情況下基本超螺旋可以超過90%。

5、用戶需要自備Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巰基乙醇)。配制方法：在600 ml 去離子水里面溶解 182.2克山梨醇，加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要調節PH值，定容到1L，4℃保存。臨用前加0.1%β-巰基乙醇(商品化的β-巰基乙醇摩爾濃度一般為14M)。

6、菌體濃度檢測一般OD600值為1的時候,釀酒酵母細胞是1-2x107 cells/ml，由于菌種和分光度計不同即使同樣細胞數量OD值變化也很大，以上僅供參考。

7、洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫，但應該確保批pH大于7.5， pH過低影響洗脫效率。用水洗脫質粒應該保存在－20℃。質粒DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。

操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）

提示：

    ● 第一次使用前請先在漂洗液WB瓶中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!

    ● 將RNase A全部加入溶液YA中，混勻。每次使用后置于2-8℃保存。

    ● 將溶液YC放在冰上預冷。

    ● 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巰基乙醇，回復到室溫備用。

1、取約100-180毫升酵母培養物，6000xg，離心10分鐘，盡可能的倒干上清，收集菌體。

收集超過50毫升菌液，可以離心棄上清后，在同一個50ml管內加入更多的菌液，重復步驟1，直到收集到足夠的菌體。

2、加入10ml Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細胞；加入0.1g 破壁酶LE（破壁酶LE臨用前用2ml Sorbitol buffer溶解），充分顛倒混勻，37℃溫育1-2小時消化細胞壁，中間可顛倒數次幫助消化。

如果破壁效果不好導致質粒產量過低，可以加大破壁酶LE用量來提高酶工作濃度，還可以延長消化時間或者提高溫度到45℃來提高效果，不適合破壁消化的酵母可選用Lyticase 或者Zymolase或者其它方法如加玻璃珠渦旋振蕩，反復凍融等。

3、6000xg，離心10分鐘，盡可能吸棄上清，加入7ml溶液YA重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮。  

如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。

4、加7ml的溶液YB，溫和地上下翻轉4 -7次使菌體充分裂解，室溫放置4分鐘。

溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時間不應超過5分鐘！以免質粒受到破壞。此時菌液應變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準確的5分鐘。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應減少菌體量。

5、加10ml溶液YC，立即溫和地上下翻轉4 -7次，充分混勻此時會出現白色絮狀沉淀。冰上靜置5-10分鐘，4℃ ，至少2500xg離心20分鐘(加大離心力可相應縮短離心時間,如15000xg離心10分鐘)，小心取上清，避免吸取到漂浮的白色沉淀。

加入溶液YC后應該立即混勻，以免產生SDS的局部沉淀，如果上清中還有飄浮白色沉淀，可再次離心后取上清。

6、可選,一般不需要:4℃，2500xg 再次離心10 分鐘，小心取上清。

7、將上一步所得上清加入吸附柱DC中（吸附柱DC放入收集管CT中），靜置2分鐘，2500xg離心2分鐘，倒掉收集管CT中的廢液。

如果上清體積超過20ml，可以分多次過柱。

8、加入10ml去蛋白液PD，2500xg離心2分鐘，棄掉廢液。

9、加入10ml漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），2500xg離心2分鐘，棄掉廢液。

10、重復操作步驟9一次。

11、將吸附柱DC放回空收集管CT中，最高速（最好大于9000xg，如果離心機轉速低，需要相應延長離心時間）離心10分鐘以干燥膜基質殘留乙醇，用槍頭吸除內圈壓環和柱壁之間可能殘留的乙醇，室溫或者烘箱晾干幾分鐘。

該步驟目的為徹底去除吸附柱中殘留乙醇，殘留乙醇抑制下游反應并且嚴重降低洗脫效率，降低質粒產量。如果洗脫產量低，則必須加做步驟12。

12、可選步驟: 選擇以下兩種方法之一干燥柱子：

        ① 取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空15分鐘；

        ② 將柱子放置于60－65℃真空干燥箱或烘箱中，放置10-15分鐘。

13、取出吸附柱DC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加1ml洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預熱效果更好），室溫放置2分鐘，6000 xg離心5分鐘。如果需要較多量質粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心2分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要質粒濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積不應少于0.6ml，體積過小降低質粒洗脫效率，減少質粒產量。