目錄號：PE109

試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。

儲存事項:

1、第一次使用時，將試劑盒所帶全部的RNase A加入溶液A后（終濃度100μg/ml）置于4℃保存。如果溶液A中RNase A失活，提取的質粒可能會有微量RNA殘留，在溶液A中補加RNase A即可。

2、環境溫度低時溶液B中SDS可能會析出出現渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

3、避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

產品介紹：

本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低pH值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅基質膜上洗脫。

產品特點：

1、離心吸附柱內硅基質膜全部采用世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。

2、不需要使用有毒的苯酚、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。快速、方便，從150-300ml大腸桿菌LB((Luria-Bertani)培養液中，可快速提取0.2-1.5mg純凈的高拷貝質粒DNA，提取率達80 %左右。

3、獲得的質粒產量高、超螺旋比例高、純度好，可以直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。

注意事項

1、本試劑盒適用菌株為XL-1 Blue、Top10和DH5α等核酸酶含量低缺陷型菌株。所用菌株為JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量豐富，應購買本公司生產的高純度質粒大量快速提取試劑盒(PE110)。

2、所有的離心步驟如未加另外說明均在室溫完成，使用轉速可以達到12,000 x g，帶50ml轉頭的臺式離心機。

3、提取質粒的量與細菌培養濃度、質粒拷貝數等因素有關。如果所提質粒為低拷貝質粒或大于10kb 的大質粒，應加大菌體使用量，同時按比例增加A、B、D的用量，洗脫緩沖液應在70℃預熱。可以適當的延長吸附和洗脫的時間，提高提取效率。

4、得到的質粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260值為1相當于大約50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。本公司產品正常操作情況下基本超螺旋可以超過90%。

5、質粒DNA確切分子大小，必須酶切線性化后，對比DNA分子量Marker才可以知道。處于環狀或者超螺旋狀態的質粒，泳動位置不確定，無法通過電泳知道其確切大小。

6、洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫， 但應該確保pH大于7.5，pH過低影響洗脫效率。用水洗脫，質粒應該保存－20℃。質粒DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫 （10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。

操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）

提示：

    ● 第一次使用前請先在漂洗液WB瓶中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!

    ● 將RNase A全部加入溶液A中，混勻。每次使用后置于2-8℃保存。

1、取150-200 ml (最多不超過300 ml)過夜培養的菌液，12,000 x g（約10,000rpm），離心1-2分鐘，盡可能的倒干上清，收集菌體。

收集超過50毫升菌液，可以離心棄上清后，在同一個50ml管內加入更多的菌液，重復步驟1，直到收集到足夠的菌體。

2、用7.5ml溶液A重懸菌體沉淀，移液器吹打或者渦旋振蕩至徹底懸浮。  

如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。

3、加7.5ml的溶液B，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解，室溫放置4-5分鐘。

溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時間不應超過5分鐘！以免質粒受到破壞。此時菌液應變得清亮粘稠。如果很渾濁，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應減少菌體量。

4、加7.5ml溶液D，立即溫和地上下翻轉6 -8次，充分混勻此時會出現白色絮狀沉淀。12,000 x g離心10-15分鐘，小心取上清至新管，避免吸取到漂浮的白色沉淀。

加入溶液D后應該立即混勻，以免產生SDS的局部沉淀。

5、向上清中加入0.5體積異丙醇（約10ml）后充分顛倒混勻后分多次（每次不超過15ml）轉入吸附柱DC中（吸附柱放入收集管CT中），12,000 x g離心1分鐘，倒掉收集管CT中的廢液。直到所有混合溶液通過此吸附柱。

6、加入10ml漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 x g離心1分鐘，棄掉廢液。再加入10ml漂洗液WB，重復漂洗一次。

7、將吸附柱DC放回空收集管CT中，最高速（最好大于12,000 x g）離心3分鐘以干燥基質膜上殘留乙醇，用槍頭吸除內圈壓環和柱壁之間可能殘留的乙醇，打開蓋子室溫晾干3-5分鐘。

該步驟為徹底去除吸附柱中殘留乙醇，殘留乙醇抑制下游反應并且嚴重降低洗脫效率，降低質粒產量。

8、取出吸附柱DC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加1-2ml洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預熱可提高產量），室溫放置3分鐘，12,000 x g離心3分鐘。 

推薦：為了增加質粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置3分鐘，12,000 x g離心3分鐘。洗脫兩遍可提高濃度約10%。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要質粒濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是需注意體積過小降低質粒洗脫效率，減少質粒產量（最小不應少于1ml）。