目錄號：PE106

適用范圍：

適用于5-15ml 中等規(guī)模質(zhì)粒制備（mind preparations）。

試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性：

本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。

儲存事項:

1、Rnase A保存在即用型甘油緩沖液中，常溫運輸，收到后，不超過25℃室溫至少保存6個月，4℃保存12個月，長期保存放-20℃

2、第一次使用時，將試劑盒所帶的全部RNase A加入溶液A后（終濃度100ug/ml）置于2-8℃保存。如果溶液A中RNase A失活，提取的質(zhì)?？赡軙形⒘縍NA殘留，在溶液A中補加RNase A即可。

3、環(huán)境溫度低時溶液B中SDS可能會析出渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

4、避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。

產(chǎn)品介紹：

本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞，質(zhì)粒產(chǎn)量提高1-2倍，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細菌成分去除，最后低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

產(chǎn)品特點：

1、特殊改進的高產(chǎn)量緩沖液配方可以把質(zhì)粒產(chǎn)量提高1-2倍。

2、獨有的去蛋白液配方，可以高效去除殘留的核酸酶，即使是核酸酶含量豐富的菌株如JM系列、HB101也可以輕松去除。有效防止了質(zhì)粒被核酸酶降解。

3、快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高、純度好， 可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測序等各種分子生物學實驗。

注意事項

1、所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達到13,000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機。

2、提取質(zhì)粒的量與細菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)?？截悢?shù)等因素有關(guān)。一般高拷貝質(zhì)粒，建議取5-15 ml 過夜培養(yǎng)14-16個小時的菌液，可提取出多達40μg-90μg的純凈質(zhì)粒。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大于10kb的大質(zhì)粒，應(yīng)適當加大菌體使用量，同時按比例增加A、B、C的用量，其它步驟相同。

3、得到的質(zhì)粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260值為1相當于大約50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒泳動位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時間長短、提取時操作劇烈程度等有關(guān)。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過90%。

4、質(zhì)粒DNA確切分子大小， 必須酶切線性化后，對比DNA分子量Marker才可以知道。處于環(huán)狀或者超螺旋狀態(tài)的的質(zhì)粒，泳動位置不確定，無法通過電泳知道其確切大小。

5、洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保pH大于7.5，pH過低影響洗脫效率。用水洗脫質(zhì)粒應(yīng)該保存在－20℃。質(zhì)粒DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時可以適當稀釋。

關(guān)于平衡液BS的使用

介紹：核酸吸附硅膠膜柱子長期放置過程中會同空氣中的電荷/塵埃發(fā)生反應(yīng)而影響其核酸的結(jié)合能力。硅膠柱經(jīng)平衡液BS預處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團，提高核酸的結(jié)合能力。從而提高硅膠柱子回收效率或者產(chǎn)量。平衡液BS是強堿性溶液，若不小心碰到，請用大量自來水清洗。用完后需蓋緊瓶蓋，以免接觸空氣。室溫保存。在保存過程中可能有沉淀生成，請加熱至37℃使沉淀完全消失。

使用方法：取一個新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管CT中，吸取100μl的平衡液BS至柱子中。12000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管CT中廢液，將吸附柱子重新放回收集管CT。此時平衡液BS預處理柱子完畢。接后續(xù)的操作步驟。

操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）

提示：

     ● 第一次使用前請先在漂洗液WB和去蛋白液PS瓶中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!

     ● 將RNase A全部加入溶液A中，混勻，每次使用后置于2-8℃保存。

1、取5-15 ml過夜培養(yǎng)的菌液，9,000rpm離心1-2分鐘，盡可能的倒干上清，收集菌體。

2、用500μl溶液A重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮，全部轉(zhuǎn)入一個2ml離心管。  

如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。

3、加500μl的溶液B，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解，室溫放置4分鐘。

溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時間不應(yīng)超過5分鐘！以免質(zhì)粒受到破壞。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準確的5分鐘。

4、加500μl溶液C，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。冰上靜置3-5分鐘，12,000rpm離心10分鐘，小心取上清。

5、加入溶液C后應(yīng)該立即混勻，以免產(chǎn)生SDS的局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

平衡液BS預處理吸附柱：

使用平衡液BS預處理硅膠膜吸附柱為必做步驟，具體方法參見前文“關(guān)于平衡液BS的使用”

6、將上層水相中加入0.5體積異丙醇（約740ul）后充分顛倒混勻后分多次（每次不超過700ul）轉(zhuǎn)入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中），12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。直到所有混合溶液通過此吸附柱。

7、加入500μl去蛋白液PS（請先檢查是否已加入無水乙醇?。?2,000rpm 離心30秒，棄廢液。

此步驟為了去除痕量核酸酶等雜質(zhì)，如所用菌株為JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量豐富，應(yīng)加此步驟；如所用菌株為XL-1 Blue和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，則可略過此步驟。

8、加入600μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

9、將吸附柱AD放回空收集管CT中，12,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

10、取出吸附柱AD，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl-250洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置2-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要質(zhì)粒濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于100μl，體積過小降低質(zhì)粒洗脫效率，減少質(zhì)粒產(chǎn)量。